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体外构建干细胞汗腺细胞融合体的初步研究

来源:[2016中国中西医结合学会医学美容学术年]时间:2016-11-22 13:59:54责任编辑:wbw

石家庄白求恩国际和平医院烧伤整形科  杨建民 王鹏 史少蕊

干细胞中心  王更银 李俊峡

石家庄市第一医院整形美容中心 刘坤坤 刘超 贾玉磊

【摘要】

目的:研究脐带间充质干细胞(UCNSC)和人汗腺细胞(SGC)合核细胞的生物学特性,为汗腺再生探索新的方法和途径。方法:1)体外分离培养UCNSCSGC,通过检测CD14CD44CD29CD105CD34CD45表达情况鉴定UCNSC,检测CK19CEA表达情况鉴定SGC。(2)制取、检测间充质干细胞/汗腺细胞合核细胞,用PKH26CFSE分别对UCNSCSGC进行标记,用聚乙二醇(PFG)化学融合法制备间充质干细胞/汗腺细胞融合体,通过荧光显微镜荧光观察筛选融合细胞后继续培养:1周后流式细胞仪检测合核细胞中CD14CD44CD29CD34CD45表达率,免疫组织化学检测CK19CEA表达情况。结果:间充质干细胞/汗腺细合核细胞的免疫组化检测CEACK19表面抗原均为阳性,流式细胞术检测表面标志物CD29CD44CD105表达率较高。结论:诱导融合后的间充质干细胞/汗腺细胞合核细胞同时具备干细胞合汗腺细胞的表型。

【关键词】间充质干细胞;汗腺干细胞;融合细胞;再生;聚乙二醇化学融合法

 

大面积严重烧伤使创面皮肤附属器官被破坏,丧失了正常分泌汗液、调节体温的功能,使患者的生活质量降低。如何解决汗腺的再生问题已成为当今研究的热点。本研究利用细胞融合技术使人脐带间充质干细胞和汗腺细胞融合产生合核细胞,理论上合核细胞保留了干细胞的可扩增特性和汗腺细胞的分泌汗液特性,为烧伤后汗腺再生提供新方法和途径。

 

1.材料与方法

1.1标本来源

脐带组织来自本院妇产科足月剖宫产的健康胎儿脐带,全层皮肤来自于本院烧伤整形科头部皮肤扩张器Ⅱ期术后的多余正常皮肤。所有标本均在无菌条件下收集处理,使用时均获得产妇及家属知情同意,并签署同意书。

 

1.2 主要试剂及仪器

DMEM/F121:1)培养基购自Hyclone公司,10%胎牛血清(PBS)购自Gibco公司、重组表皮细胞生长因子(EGF)购自Pepro Tech公司,三碘甲状腺原氨酸(T3)、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)、PKH26细胞染色试剂盒购自美国Sigma公司,琥珀酰氢化考的松购自Calbipchem公司,胰蛋白酶/EDTA消化液自Solarbio公司,GEP细胞融合实际盒购自上海杰美基因医药科技有限公司,CFDA SE细胞增殖与失踪检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

 

1.3脐带间充质干细胞的获得及其标记

用组织块培养法获得UCMSC,将二代脐带间充质干细胞制成单细胞悬液,离心、取沉淀,用稀释液C重悬细胞后,放入PKH26工作液中染色1-5min,血清终止反应,DMEM/F12完全培养基洗涤2次后正常培养(具体操作步骤按说明书进行)。荧光显微镜下观察标记效果。倒置相差显微镜下观察标记后细胞形态。

 

1.4人汗腺细胞的获得及标记

用胶原酶消化法获得SGC,将一代汗腺细胞消制单细胞悬液,离心、取沉淀,加入CFDA细胞标记液和CFDA SE储存液(2X)进行标记,完全培养液(含血清)终止标记,洗涤三次后正常培养(具体操作按说明书进行)。在荧光显微镜下观察标记效果。

 

1.5 间充质干细胞/汗腺细胞融合及筛选

融合方法:分别取对数生长期已标记的P3代脐带间充质干细胞和已标记的P0代汗腺细胞,传代24小时候用5mlGENMED清理液(reagentA)清洗,分别加入4×106的两个父代细胞到一个50ml锥形离心管,300×g离心10min,去上清后用10ml GENMED清理液(reagentA)洗涤一次,取细胞沉淀加入105ml GENMED融合液(reagent B)混匀,置室温下1min,用10ml GENMED清理液(reagentA)洗涤一次,去上清后正常培养(具体操作步骤按说明书进行)。在倒置相差显微镜下观察融合后细胞形态。

筛选方法:换液后调整细胞为1~5个细胞/ml;取96孔板,每孔加入细胞悬液200µl。孵育于375%CO2孵箱中;待细胞贴壁后,在荧光显微镜下标记出同时显影红色荧光和绿色荧光的孔,将标记孔内的细胞收集后培养,视细胞生长情况检测并扩大培养。

1.5观察指标

间充质干细胞和人汗腺细胞,分别进行流式细胞仪、免疫组织化学检测;培养1周后的合核细胞同时行流式细胞仪和免疫组织化学检测。

1.6 统计学处理

利用SPSS16.0软件进行统计分析,数据均以均数±标准差表示,检验标准a=0.05,P<0.05为差异具有统计学意义。

 

2.结果

2.1 UC-MSCs分离、培养基鉴定

培养1周后可见较多UCMSC呈梭形成纤维样细胞生长;2周后达80%融合,传代培养后细胞形态良好,流式细胞术结果显示,对分离培养的UC-MSCs进行流式细胞术检测,干细胞表面标志物CD29、CD44、CD105表达率较高,分别为99.9%、99.8%、95.7%;造血干细胞表面标志物CD14、CD34、CD45几乎不表达,分别为0.0%、0.2%、0.2%。提示本实验分离、培养的细胞是交纯化的间充质干细胞,可以用于实验研究,PKH26标记后的间充质干细胞在荧光显微镜下观,细胞呈现红色荧光,染色较均匀,细胞贴壁好(图1)

PKH26标记后的间充质干细胞

1 PKH26标记后的间充质干细胞

现红色荧光 荧光显微镜×300

 

2.2 汗腺细胞(h-SGCs)的培养

培养7天后,已有汗腺贴壁,镜下可见少量汗腺团块周围爬出不规则形细胞,呈集落状生长;10天后,镜下可见汗腺团块周围爬满不规则细胞,呈铺路石样生长,CEACK19表面抗原检测为阳性(图2),CFDA SE标记后的汗腺细胞在荧光显微镜下观,呈现为绿色荧光,染色较均匀(图3)。

培养10天后的汗腺细胞成铺路

2 培养10天后的汗腺细胞成铺路

石样 倒置相差显微镜×40

 FDA SE 标记的汗腺细胞呈现 为绿色荧光

3 FDA SE 标记的汗腺细胞呈现

为绿色荧光  荧光显微镜×300

 

2.3

干细胞/汗腺细胞融合细胞的筛选、鉴定;在荧光显微镜下融合细胞同时显示红色荧光和绿色荧光,红色荧光主要分布在细胞膜,绿色荧光主要在细胞质尤其是细胞核附近。融合细胞高表达部分干细胞表面标志物CD29CD44CD105表达率分别为69.1%64.1%99.0%(图4),融合细胞CEACK19表面抗原检测为阳性(图5

 图4 融合细胞高表达部分干细胞表面标志物CD29、CD44、CD105,表达率分别为69.1%、64.1%、99.0%

 4 融合细胞高表达部分干细胞表面标志物CD29CD44CD105,表达率分别为69.1%64.1%99.0%

 免疫组织化学检测融合细胞CEA合CK19表面抗原为阳性

5  免疫组织化学检测融合细胞CEACK19表面抗原为阳性

 

2.4

统计学分析;融合细胞CEACK19阳性率分别为78%85%,对照组CEACK19的阳性率分别为7.5%3.5%P<0.05)有明显统计学差异(见表1)。同时以上实验结果提示此次试验分离、培养、诱导融合的干细胞/汗腺细胞融合体同时具有部分干细胞的生物学特性和汗腺细胞的生物学特性。

1 对照组和实验组免疫组化染色CEA和CK19表达情况比较(% `x±s)

组别

天数(d)

样本数

CK19

CEA

对照组

7

8

7.5±1.3

3.5±0.8

融合租

7

8

58.0±3.2*

78.0±2.9*

与对照组比较:*P<0.05

 

讨论

大面积深度烧伤幸存者因汗腺损毁或瘢痕增生,使皮肤丧失了正常分泌汗液、调节体温的功能,严重影响患者的生活质量[1]。无论是应用自体皮片或普通组织工程皮移植创面均无法使汗腺再生,因此如何实现大面积深度烧伤创面汗腺的重建,成为目前亟待解决的难题。

随着再生医学深入发展,为解决以上难题提供了新的思路。细胞融合最早是Barski等于1961年首次发现,此后相继研究处3类成熟的细胞融合技术:①生物法:灭火病毒诱导细胞融合。②化学法:聚乙二醇(PEG)诱导细胞融合③物理法:电脉冲诱导细胞融合和激光诱导细胞融合[2-4]、从理论上可以说利用细胞融合技术可以使任何两个细胞通过体细胞杂交融合而形成新的生物资源,它是继基因工程技术出现并发展以来一种更为有效转移遗传物质的手段[5]。本次试验中将间充质干细胞与汗腺细胞杂交融合形成了新的资源,我们得到了一种既能快速扩增,又能分泌汗腺的细胞。

人脐带间充质干细胞UC-MSCs作为试验中父代细胞之一是因为其具有来源充足,获取时无创。原代培养容易,纯度高等特点[6-8],更重要的是UC-MSCs抗原性低,免疫系统排斥小,同原始细胞更加接近,可作为临床上各种异体间移植的重要干细胞来源[9-10]。这利于将融合细胞用于同种异体尖移植为以后临床实验打基础。本次实验用于干细胞取代肿瘤细胞,作为父代细胞,这使得容二虎细胞移植到人体成为可能,也为其他融合实验提供了一种新的思路,而且与有免疫缺陷的重力细胞株相比,MSCs来源丰富、分离培养相对简单[11-13]。

汗腺细胞的特异性抗原标志物还没有发现。但研究发现CEA,在胎儿和成人皮肤的汗腺导管部、分泌部均有表达,在胎儿的小汗腺中也有表达,在表皮的其他部位不表达。CK19是上皮细胞的特异性抗原标志物,在汗腺细胞中也有表达。因此,本实验用CEA与CK19作为汗腺细胞的表面标志物进行免疫组织组化检测。

间充质干细胞和汗腺融合的现象在国外早有报道,2005年我国学者在国内首次报道了间充质干细胞和汗腺细胞融体,并做了相关检验证明融合体同时表达间充质干细胞和汗腺细胞两个亲本的标志性细胞表面标记物[14]。在这之间和以后的时间里,许多学者又对融合体做了相关研究和报道,这为本次实验提供了一定的理论基础。之前多名学者发现已分化的体细胞能够通过重编程转化回多能干细胞,而且通过干细胞和体细胞的细胞融合,可使体细胞重编程[15],这在细胞移植领域具有重要意义。细胞融合致体细胞重编程速度快、效率高,是一种研究重编程机制的重要手段。本次试验将多能MSCs与成体SGCs融合,对其融合体进行检测看是否保留多能MSCs与成体SGCs两者的特征,为进一步用融合细胞进过诱导培养分化成汗腺器官做初步研究。

我们将有限稀释法和双荧光标记相结合,成功挑选出干细胞与汗腺细胞融合体,这种方法使得干细胞代替有免疫缺陷的肿瘤细胞作为父代细胞应用于融合实验。其中双荧光标记本次实验采用的是PKH26和CFDA-SE。PKH26作为一种红色荧光染料,可以与细胞膜不可逆地结合,从而对细胞进行荧光标记,是一种简便的标记细胞的方法[16-17]。CFSE(二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)作为一种绿色荧光,是一种细胞膜穿透性荧光染料,不可逆地与细胞内蛋白的Lysine残基或其他氨基结合,且不会引起细胞发生凋亡或死亡[18]。这两种染料对细胞的毒害作用小,减少了干细胞和汗腺细胞融合的不确定因素。

本次试验中干细胞与汗腺细胞融合形成的细胞株,成功解决了再造汗腺组织工程中种子细胞严重缺乏这一瓶颈问题。以往实验中干细胞转化为汗腺细胞转化率太低,汗腺细胞不能大量获取,阻碍了汗腺细胞转化为汗腺组织的实验进程,通过本次实验使得研究人员可以随时通过复苏细胞株来得到大量能分泌汗液的汗腺样细胞,以便接下来得实验研究。本次实验方法虽然复杂繁琐。但其结果融合细胞的成功筛选、鉴定已经证明了融合技术在汗腺再生这一研究领域的可行性,为大面积重度烧伤汗腺器官重建指明了一个新的研究方向,因研究条件及研究时间的限制,本次实验并未对干细胞/汗腺细胞的杂合细胞做进一步检测,融合细胞是否具有致瘤性仍需进一步动物实验来论证。

参考文献

1 Schon M,Benwood J,O Connell2Willstaedt T,et al .Human sweat gland myoepithelial cells express a unigue set of cytokeratins  and reveal the potential for alternative epithelial and mesenchymal differentiation states in culture[J].J Cell Sci ,1999,112(12):1925-1936

2 郑国錩,王新宇,聂秀菀等 细胞融合(Cytomixis)研究的进展与展望。中国科学基金,2000,06(01):19-22

3 霍乃蕊,孟利梅 细胞融合技术的应用研究进展。动物医学进展,Progress In Veterinary Medicine,2005,26(03):32-35

4 李保华 细胞融合技术研究进展 安徽农业科学,2008,36(15):6187-6188

5 赵志强 郑小琳 张思杰等 细胞融合技术 生物学通报,2005,40(10)40-41

6 Karahuseyinoglu S,Cinar O,Kili E,et al.Biology of the stem cells in human umbilical cord stroma;In situ and in vitro surveys .Stem Cells ,2007,25(02):319-331

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10 Cecilia Gotherstro,Olle Ringde ,Charlotte Tammik ,et al.Immunologic properties of human fetal mesenchymal stem cells .American Journal of Obstetrics and Gynecology,2004,190(01):239-245

11 郝白露,杨瑞峰,彭祥炽等 改良的人脐带间充质干细胞的培养方法。中国计划生育学杂志,2013,21(01):44-49

12 孙建华,丁镌 人脐带间充质干细胞的生物学特性与研究进展,临床输血与检验,2013,15(02):90-195

13 孙丽,于丽,张华芳等 人脐带间充质干细胞的分离培养及生物学特性。解剖科学进展,2011,17(02):131-134

14 李海红,付小兵,周岗等 人骨髓间充质干细胞与汗腺细胞共同培养诱导细胞表型转化的初步研究,中华医学杂志,2005,85(27):1885-1889

15 吴畏,徐海伟,屈娅等 细胞融合致体细胞重编程机制研究进展。生命科,2012,24(04):380-384

16 Haas J,Bauer P,Rolfs A,et al.Immunocytochemical characterization of in vitro PKH2621labelled and intracerebrally transplanted neonatal cells[J].Acta2Histochem,2000,102(3):273-280

17 Boutonnat J,Muirhead KA,Barbier M,et al.PKH26 probe in the study of the proliferation of chemoresistant leukemic sublines[J].Anticancer Res ,1998,18(6A):4243-4251

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