王幕¹ 周志钢¹ 董肇杨³ 唐雪鸿⁴ 曾勇³ 朱丽倩¹

武警上海市总队医院院级课题

【摘要】

放射性损伤创面作为一种难治性创面，其愈合过程由多种细胞因子参与调控，并发挥不同的生物学效应。但目前对于难愈性创面愈合的研究多采用单一的细胞因子，虽可取得一定的效果，但作用时间短、作用机制单一、疗效不稳定，副作用大。羟基乙酸共聚物（PLGA）为骨架材料包裹效应分子制成微球制剂，无毒、可降解和生物相容性好，可在有效时间点释放发挥作用，是目前基因治疗的新型载体，本研究利用PLGA载体转入促进创伤愈合的多种生长因子，采用小鼠放射性损伤创面的模型，研究其在修复难治性创面的效果，为探索难治性创面的愈合机制及治疗难题提供新的思路和治疗措施。

背景：放射性损伤创面的愈合过程由多种细胞因子参与调控，并发挥不同的生物学效应，利用PLGA载体转入促进创伤愈合的不同生长因子，是促进此难愈创面愈合的有效措施。

目的：研究VEGF、bFGF纳米微囊复合体对放射性损伤创面愈合的影响。方法：以PLGA为支架联合应用VEGF、bFGF构建纳米微囊，作用于小鼠放射性损伤创面作为实验组，未用VEGF、bFGF的做为对照组，观察两组创面愈合率、创面的病例改变；于伤后不同时间检测创面新生血管细胞数目、毛细血管截断面积及成纤维细胞数量；RT-PCR检测创面VEGFmRNA、bFGFmRNA的表达水平；观察其对放射性创面愈合的影响。结果：对于放射性损伤的小鼠创面，应用bFGF、VEGF构建纳米微囊后，其创面愈合明显高于对照组；实验组中的创面组织中VEGFmRNA、bFGFmRNA的表达均高于对照组，两组之间比较具有显著性差异（P<0.05）；对创面组织HE染色，发现实验组肉芽组织增多增厚，成纤维细胞数量级密度均高于对照组；伤后第8天、第15天，实验组的新生毛细血管数量及毛细血管横截面积均较对照组有所增加，实验组的成纤维细胞计数明显高于对照组，两组之间比较均具有显著性差异（P<0.05）。结论：VEGF、bFGF纳米微囊复合体可以明显促进小鼠反射性损伤创面的愈合。

【关键词】血管内皮生长因子；碱性成纤维因子；纳米微囊；放射性损伤；创面愈合

1.引言

放射性物质所导致的慢性创面损伤与普通的损伤不同，射线可穿透深部组织，引起创面延迟愈合，是临床上难以处理的问题^[1]。研究表明不同的生长因子，尤其是促进血管再生的细胞分子如血管内发生长因子（VEGF）、碱性成纤维因子（bFGF）、血小板衍生因子（PDGF）等，在组织修复、创面愈合过程中发挥重要作用^[2-3]。但在发射型损伤的创面中，上述细胞因子表达降低。近年来研究^[4]发现聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）做为特殊的载体支架结合促进创伤愈合的细胞因子如bFGF或VEGF等可以促进创伤愈合。考虑到床上愈合过程中在不同阶段涉及到多种细胞因子，为此我们以PLGA为支架，联合应用bFGF、VEGF，观察其对放射性损伤创面愈合的作用，为临床上治疗放射性损伤特供新的思路。

2.材料与方法

2.1设计：以动物创面为观察对象，进行对比观察

时间及地点：实验于2013年8月至2014年10月在武警上海总队医院及第二军医大学免疫研究所共同完成

2.2材料

2.2.1实验动物：取48只体重（22±4）g健康雄性4-6周龄的C57BL/6小鼠由上海第二军医大学实验动物中心提供。

2.2.2方法：

VEGF/bFGF-PLGA的制备

将25mgPLGA、25mgPluronic F-127溶解在2ml二氯甲烷中职称有机相。300ng VEGF、300ngbFGF、4ug肝素钠和200ug人血清白蛋白加入水中制成200ul的水相。有机相与水相涡旋30秒混匀，形成油包水的乳剂。在磁力搅拌下将这个油包水的乳剂注入到25ml乙醇中。所得到的悬浮液用25ml水稀释。将上述液体在30℃温度下旋转挥干，此纳米粒便浓缩在水相介质中。没有载药的纳米粒制备时在水中未加入VEGF和bFGF，余方法同上。采用25kGyCo60照射灭菌，低温保存。

实验动物及分组

取48只体质量（22±4）g健康雄性4-6周龄的C57BL/6小鼠，将小鼠按6Gy 60Co-r射线进行一次性全身辐射建立辐射损伤动物模型。小鼠采用全麻后，于无菌条件下在小鼠背部致1cm×1cm全层皮肤缺损伤口，创面不予缝合，以单纯没有载药的PLGA覆盖创面小鼠做为对照组(24只），载有VEGF和bFGF-PLGA覆盖创面的小鼠做为实验组（24只），两组小鼠创面均以TegadermTM贴膜包扎伤口，伤后小鼠自由饮食，隔日换药，分笼饲养。

2.3创面愈合率比较

小鼠建立创面后当天采用TegadermTM贴膜覆盖创面，在透明膜上沿创面边缘描记，然后用Image Proplusv 1.5分析图像软件，测量创面面积作为伤口原始面积。采用同样方法在伤后第4、8、15天测量伤口残余面积，创面愈合率（%）=（1-残余面积/原始面积）×100%

标本取材病例监测

在两组小鼠致伤后7天以过量麻醉药物至死后取创伤创面组织，包括伤口周围部分正常皮肤和创面下方的薄层肌肉组织，采用4%多聚甲醛溶液内固定，石蜡包埋，做成组织切片，常规H-E染色，观察两组病理区别。

创面新生毛细血管数目、毛细血管截断面积及成纤维细胞计数

在两组小鼠（每组24只），分别在致伤后4天、8天、15天（每个时间点八只），处死小鼠后，取创面组织，同上述方法做成组织切片，每张切片在高倍（400×10）显微镜下随机选取10个视野，计数新生毛细血管、成纤维细胞数目，计算毛细血管截断面积，分别取其平均值。

Real-timePCR检测组织中VEGF、bFGFmRNA表达

在两组小鼠致伤2周后，每组取八只，取局部创面组织，按试剂盒说明步骤提取总RNA，紫外分光光度仪测A260/A280值，并计算RNA浓度。反转录获得cDNA文库，采用SYBR PT-PCR试剂盒和StepOneTM实时定量PCR定量检测系统进行测试。以标本内GAPDH mRNA做为细胞内mRNA表达的基准，1代表对照组标本内目的基因表达水平，依照2-△△Ct方法进行评估，对实验组标本内测试基因表达水平进行标准化比对。所有检测均进行三次独立的重复操作。

2.4统计学分析

相关数据录入SPSS16.0统计软件，进行统计分析，其中如P<0.05则认为两组间存在统计学上的差异。采用均数±标准差（x±s）方式表示所有相关数据。采用单因素方差分析的统计学方法进行组与组之间比较分析。

3结果

3.1放射性损伤小鼠背部创面应用VEGF/bFGF-PLGA后创面愈合率与对照组比较

表1：两组在创伤后不同时间点创面愈合率比较

*P<0.05

如表1显示，放射性损伤创面应用VEGF/bFGF-PLGA后，在伤后不同时间点（术后第4天，第8天，第15天）未应用VEGF、bFGF的对照组比较，在伤后第4天，治疗组的创面愈合率要大于对照组，但两者之间比较未见显著性差异。治疗组在伤后第8天及第15天，创面愈合率要高于对照组，两组之间比较具有显著性意义（P<0.05）。

3.2

放射性损伤小鼠背部创面应用VEGF/bFGF-PLGA15天后创面（实验组）与对照组比较，选取放射性损伤小鼠背部创面应用VEGF/bFGF-PLGA与未用VEGF/bFGF-PLGA的对照组小鼠，在创伤后15天分别取创面组织，观察创面组织中VEGF、bFGFmRNA的表达，结果（如图1显示）发现实验组中的创面组织中VEGFmRNA、bFGFmRNA的表达均高于对照组，两组之间比较具有显著性差异（P<0.05）。

图1：放射性损伤创面应用VEGF/bFGF-PLGA15天后与对照组两组间VEGFmRNA、bFGFmRNA表达的比较

3.3病理组织学结果

在致小鼠放射性创伤后7天，以小鼠创面给予未截细胞因子的纳米颗粒处理的做为对照组，VEGF/bFGF-PLGA纳米颗粒覆盖创伤面的小鼠做为实验组，取创面组织做常规HE染色观察发现：如对照组图中所示，创面肉芽组织层偏薄，新生的毛细血管较少，成纤维细胞少；采用VEGF/bFGF-PLGA的实验组中，肉芽组织增多增厚，成纤维细胞数量及密度均高于对照组。

3.4

放射性损伤小鼠背部创面应用VEGF/bFGF-PLGA后创面（实验组）与对照组的创面新生毛细血管数目及毛细血管横截面积比较

如图2显示，在伤后第4天，应用VEGF/bFGF-PLGA的实验组创面新生毛细血管计数及毛细血管横截面积均高于对照组，但两组之间未见显著性差异（P>0.05），在伤后第8天、第15天时，实验组的新生毛细血管数量及毛细血管横截面积均较对照组有所增加，两组之间比较均具有显著性差异（P<0.05）。

图2：放射性损伤创面应用VEGF/bFGF-PLGA后，实验组与对照组两组间毛细血管计数及毛细血管横截面积的比较

3.5

放射性损伤小鼠背部创面应用VEGF/bFGF-PLGA后创面（实验组与对照组的创面成纤维细胞计数比较

如图3显示，在伤后第4天，应用VEGF/bFGF-PLGA的实验组创面的成纤维细胞计数要略高于对照组，但两组之间未见显著性差异（P>0.05），而伤后第8天、第15天时，实验组的成纤维细胞计数明显高于对照组，两组之间比较均具有显著性差异（P<0.05）。

图3：伤后不同时间点，放射性损伤创面应用VEGF/bFGF-PLGA的实验组与对照组的成纤维细胞计数比较

4.讨论

临床放射性治疗、核辐射等所导致的组织损伤，局部组织损伤严重，细胞生存环境变化大，尤其是当这一类病人在合并全层皮肤组织创伤及深层组织损伤时，其伤口的愈合及其困难，甚至形成难愈性创面，给患者的生活和经济带来很大的负担。研究表明放射性损伤愈合困难的主要原因在于创伤早期炎性反应削弱、成纤维细胞和上皮细胞增殖减少；后期肉芽组织及胶原基质产生减少，使上皮化减慢。^[5]

近年来的研究表明在促进放射性损伤创面愈合方面，不同生长因子在创伤愈合的不同阶段发挥着重要的作用^[6-7]。创伤的组织修复及愈合过程中包含着诸多如细胞的分裂及迁移、合成新的基质、新生的血管形成、新生的上皮细胞等细胞参与的活动^[8-9]。但细胞生长因子在创面促愈的过程中均存在着半衰期短的问题，需要特定的保护剂和良好的投递系统的存在才能发挥作用，同时创面中所包含的间充质细胞及炎症细胞也通过其释放到创面组织中的酶，降解发挥促进愈合的细胞因子，使其发挥的作用大大学削弱^[10-12]。基于上述原因，因此需要特殊的载体物质使发挥作用的生长因子持续作用于创口，才能更有力于创面修复。近年来的一些研究结果^[15-17]表明，利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球做为新型的载体混合生长因子制成复合缓释剂，不仅具有无毒、可生物降解和生物相容性好等特征，而且其降解的时间可受分子量和聚合物含量比例的调节，很大程度上保持了生长因子的活性和持续释放，真正达到了加速创面的愈合、提高其愈合质量的目的。

慢性放谁像你个损伤创面的修复比较复杂，肉芽组织增生是其中重要一环，其主要由新生毛细血管及成纤维细胞组成。研究发现促进血管生成及成纤维细胞生成的细胞因子，可以加速创面愈合。^[16]血管内皮生长因子（VGEF)特异性地与血管内皮细胞作用，并可使序贯的通透性增加，血浆蛋白渗出到血管周围的间隙中，渗漏到血管周围的纤维蛋白原会转化成纤维蛋白，促进血管形成并不断扩大生长。^[17]碱性成纤维因子（bFGF）是一组多肽，其生物学活性比较广泛，其可作用于血管内皮细胞，促进其有丝分裂，诱导血管内皮细胞分泌某些蛋白酶，溶解并侵入周围基质，进而形成毛细血管；同时促进内皮细胞及成纤维细胞向创面迁移，加速创面的愈合。^[18]

本实验通过构建小鼠的放射性损伤模型，以PLGA为支架，联合应用bFGF、VGEF，观察VEGF/bFGF-PLGA在放射性损伤创面愈合中的作用及可能机制。研究发现在放射性损伤小鼠背部创面应用VEGF/bFGF-PLGA15天后，创面组织中VGEF、bFGFmRNA的表达明显升高，同时治疗组在伤后第8天及第15天，创面愈合率要高于对照组，两组之间比较具有显著性意义（P<0.05），提示在放射性损伤创面应用VEGF/bFGF-PLGA后，创面可以持续地高表达bFGF和VGEF，进而促进创面的愈合。

通过本实验对放射性损伤小鼠背部创面应用VEGF/bFGF-PLGA后的病理分析发现，应用VEGF/bFGF-PLGA第8天及第15天后，实验组的新生毛细血管数量及毛细血管横截面积均较对照组有所增加，两组之间比较均具有显著性差异（P<0.05）；同时实验组的成纤维细胞计数也明显高于对照组，两组之间比较（P<0.05），均具有显著性差异。上述研究进一步说明VEGF/bFGF-PLGA促进创伤愈合的机制可能在于其使放射性损伤创面的肉芽组织中bFGF、VEGF的mRNA表达升高，使bFGF、VEGF发挥共同的作用，促进了创面新生血管的生成及成纤维细胞的增殖，改善了创面的血液循环，从而使创面愈合速度加快，促使放射性损伤创面愈合。本实验的研究为丰富难愈伤口的理论提供了一定的实验基础，并为治疗放射性损伤创面提供了新的思路。

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基金资助：上海市卫生局科研课题（编号20114341），武警上海总队医院院级科研基金项目。

作者贡献：第一作者进行实验设计，第一、三、四、五、六作者负责实施，第一作者负责成文、第二作者知道实验研究并审校。

利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。

伦理要求：研究中涉及的动物处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的要求。

文章概要

以PLGA为支架联合应用bFGF、VEGF构建纳米微囊，使其作用于小鼠放射性损伤创面，研究利用PLGA载体转入促进创伤愈合的多种生长因子在修复难治性创面的效果，为探索难治性创面的愈合机制及治疗难题提供新的思路。

关键信息：

放射性损伤创面的愈合过程中不同的细胞因子发挥不同的作用，采用PLGA载体携促进创伤愈合的因子，可以持续作用于创面，可能为临床上治疗放射性创伤提供新的思路和治疗措置。

研究的创新之处和不足：

成功的建立了VEGF、bFGF聚乳酸-羟基乙酸纳米微囊复合体，并使其作用于小鼠的放射性损伤创面，促进了此种难愈性创面的愈合，为临床上治疗难愈性创面提供了理论依据。不足之处在于目前相关的研究还处于动物实验阶段，要应用到临床，效果如何仍有待深入研究。