闫丙建 苑丰  赵彩玲  刘肃

【摘要】

目的：研究真皮内注射二甲氨基乙醇（DMAE）复合制剂（赛雷弗®）对亚急性衰老 大鼠皮肤胶原代谢及TGFβ1/smads 通道的影响。方法：30只Wistar大鼠随机分入衰老胜利 盐水组（A组）、衰老治疗组（B组）、正常对照组（C组），每组10只。A、B两组颈背部皮下注射D-半乳糖125mg/kg/d，连续42天。从第18天开始于A、B组大鼠臀背部分别注射生理盐水和赛雷弗®1ml，每周一次，连续四周。每次治疗后3天进行活体皮肤聚焦纤维镜检测。42天处死所有大鼠，取注射药物区域皮肤，观察各组皮肤真皮厚度、胶原纤维密度和皮肤羟脯氨酸（HYP）含量的变化，RT-PCR法检测皮肤组织TGFβ1、smad3、Ⅰ、Ⅲ型前胶原（colⅠ  colⅢ)mRNA表达量，以及免疫组化法检测成纤维细胞增殖细胞核抗原（PCNA）和TGFβ1的表达。结果：衰老治疗组与衰老生理盐水组大鼠相比真皮厚度、胶原纤维密度、羟脯氨酸含量显著增加，皮肤组织colⅠ、TGFβ1、smad3 mRNA表达量增加（P<0.05),而对olⅢ mRNA及PCNA表达量没有影响。结论：真皮内注射赛雷弗®可正调节衰老皮肤中成纤维细胞TGFβ1/smad3基因表达，促进Ⅰ型胶原蛋白合成，增加衰老皮肤中胶原的含量和真皮厚度，具有抗衰老作用。

【关键词】抗衰老；真皮内注射；DMAE复合制剂（赛雷弗®）；TGFβ1/smads 通道

引言

目前DMAE作为一种新型成分具有可观的抗衰老效果[1]，而临床应用DMAE均为外用品，其大剂量用药不单增加其相应的副作用和毒性，其安全性和有效性尚不能让人满意也增加了病人的医疗负担。所以在美学药物领域，人们需要更为有效的和安全微创的DMAE基础产品得需求也越来越强烈。

本实验所应用的DMAE复合制剂（赛雷弗® ，加拿大spacon公司）是一种专利产品，其主要成分为0.1%DMAE、多种氨基酸维生素，矿物质微量元素及透明质酸。本实验通过检测试验大鼠皮肤组织学变化和基因水平来探究其调节胶原代谢、延缓皮肤衰老的作用机制，为DMAE复合制剂安全、有效的应用于临床提供一定的实验依据。

1.材料和方法

1.1主要实验仪器及试剂：DMAE复合制剂、D-半乳糖；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、扩增试剂盒；其余试剂均为市售分析纯；实验仪器：共聚焦纤维镜；超声细胞粉碎仪仪；荧光定量PCR仪。

1.2实验动物和方法

1.2.1实验动物：健康雄性6周龄（220±20）g Wistar大鼠30只，由青岛市药物研究中心提供。

1.2.2实验分组：30只年轻健康Wistar大鼠随机平均分成衰老生理盐水组（A组）、衰老治疗组（B组）、正常对照组（C组）。

1.2.3动物模型建立：A、B组颈背部皮下注射D-半乳糖125mg·kg-1·d-1，连续给药42天，制作成大叔衰老模型[2]。C组大鼠颈背部皮下注射等量的生理盐水。从注射D-半乳糖18天开始，脱去大鼠臀背部两侧毛发，于臀背部纹身标记以直径为3cm的圆形治疗区域。A、B组大鼠于标记区域内皮肤真皮内多点，均匀注射生理盐水和DMAE复合制剂各1ml，每周1次，连续4周。

1.3实验标本及取材方法：

第42天，麻醉后处死大鼠，沿文身标记线内侧1mm处切取皮肤标本，留取少量组织以10%中性多聚甲醛固定，石蜡包埋切片拟作形态学观察。其余部分，液氮无菌管冻存待测。

1.4指标观察：

（1）每次真皮内注射治疗后3天进行活体皮肤共聚焦显微镜观察大鼠真皮胶原纤维密度变化。

（2）组织学观察：HE染色、masson染色观察真皮厚度、胶原纤维形态及密度。

（3）免疫组化分别测定成纤维细胞PCNA及TGFβ1的表达。

（4）生化指标：检测HYP含量

（5）RT-PCR检测皮肤colⅠ、colⅢ、TGFβ1、smad3 mRNA表达量，采用2一△△CT方法分析基因表达结果。

1.5组织学测量：

40倍镜下于每张HE染色切片随机选取5个不重叠视野留取图片，masson染色、TGFβ1及PCNA免疫组化染色后400倍镜下随机获取5个视野，IPP图像分析软件进行真皮厚度、胶原纤维密度、TGFβ1累计光密度进行定量分析，计算PCNA阳性细胞个数。各个测量指标的每张切片取其平均值。

1.6统计学方法：

各组测量数据应用SPSS17.0软件进行统计学分析。计量数据用x±s表示，采用单因素方差分析检验组间差异，P<0.05表明差异有统计学意义。

2.结果

2.1皮肤共聚焦显微镜检测结果：可见衰老生理盐水组大鼠皮肤胶原纤维逐渐变得稀疏；衰老治疗组胶原纤维一开始呈现和衰老生理盐水组类似的稀疏排列的胶原纤维，但随着真皮内注射次数的增加，胶原纤维排列渐趋致密，并伴有新生的毛细血管；而正常对照组胶原纤维排列致密均匀，前后无明显变化（图1）。

2.2组织学观察：

HE染色及masson染色可见衰老治疗、正常对照组大鼠皮肤较衰老生理盐水组厚（描述用术语），且衰老生理盐水组皮肤胶原纤维排列疏松，胶原纤维厚度变薄，胶原束细长、断裂、排列紊乱。图2

2.3各组真皮厚度和胶原纤维面积的系统定量分析 测量结果示衰老生理盐水组大鼠真皮厚度和胶原纤维面积显著低于衰老治疗、正常对照组，且衰老治疗组的真皮厚度显著低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。但是masson染色结果显示衰老治疗组皮肤胶原纤维面积与正常对照组大鼠相比差异无统计学意义（P>0.05）表1、图2、图3.

2.4HYP含量：衰老治疗与衰老生理盐水组相比皮肤HYP含量显著增加，但仍低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）结果见表2.

2.5免疫组化结果：衰老各组PCNA阳性数量较正常对照组均减少（P<0.05），且衰老治疗组与衰老生理盐水组之间没有差异（P>0.05）图4，TGFβ1的累计光密度结果显示衰老2组TGFβ1累计光密度均下降（P<0.05），但衰老治疗组累计光密度较衰老生理盐水组高，差异有统计学意义（P<0.05）图5.结果见表1.

2.6RT-PCR结果

实时荧光定量PCR检测结果显示衰老生理盐水组与衰老治疗、正常对照组大鼠相比colⅠ、TGFβ1、smad3 mRNA表达量均减少，但衰老治疗组TGFβ1mRNA表达量仍显著低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），衰老治疗、正常对照组colⅠ和smad3 mRNA表达量差异无统计学意义，colⅢ基因表大量在三组之间没有差异（P>0.05）表2.

3.讨论

Mesotherphy疗法作为一种简单、有效、微创的注射技术通过将药物直接注射于需作用部位，具有显效快，疗效明显，微创、恢复期短等优点并能减轻传统给药方法所产生的副作用，目前根据Mesotherphy疗法理念真皮内注射作为一种新的治疗技术被广泛应用于皮肤美容机机体塑形等[3]。

赛雷弗®是一种混合制剂，其主要成分为0.1%DMAE、复方氨基酸、多种维生素及矿物质、微量透明质酸。目前DMAE其具有即可抗衰老、面部提升和抗皱的疗效而受到广泛的关注，临床研究发现3%DMAE凝胶外用具有良好的美容效果，包括改善额纹、眶周细纹、唇厚度和形状，以及整个面部皮肤的外观，但其毒副作用可使成纤维细泡空泡化[4]，而2.5%DMAE培养人类成纤维细胞亦可导致空泡的出现，这都被认为是高浓度DMAE的细胞毒性所引起，浓度反应研究显示低于1mmol/L培养成纤维细胞通常无空泡化效应[5]。最近研究表明0.1%DMAE+氨基酸溶液真皮内注射可启动胶原蛋白合成过程并增强皮肤抗氧化能力，同时还可以有效减轻其细胞毒性[1,6]。健康年轻化的皮肤胶原纤维代谢需要多种原料，维生素、氨基酸、及矿物质都是皮肤胶原合成所需要的原料。本着真皮内注射疗法的治疗理念，本实验采用低浓度DMAE并添加多种皮肤需要的营养物质的混合制剂真皮内注射，以探究其作为一种新型抗衰老药物的抗衰老效果及其机制。

长时间高剂量注射D-半乳糖可导致细胞功能及代谢紊乱，形成过量的超氧阴离子自由基，加速机体衰老[2,7]。衰老生理盐水组与正常大鼠相比出现体重减低，反应迟缓，毛瑟枯黄，精神萎靡，免疫力降低；组织学上表皮、真皮变薄，皮肤胶原含量减少，胶原纤维疏松，排列紊乱。此外，衰老生理盐水组大鼠皮肤Ⅰ型前胶原蛋白mRNA表达量及皮肤HYP含量减少。皮肤CT结果可见衰老生理盐水组大鼠胶原纤维逐渐稀疏。以上数据表明D-半乳糖所致亚急性衰老大鼠造模成功，可用于本项研究。

皮肤的老化现象的出现主要体现在真皮胶原代谢的改变[8]。真皮胶原蛋白主要由Ⅰ、Ⅲ型组成，而健康成人皮肤Ⅰ型胶原纤维中占80%[10]。皱纹形成、弹性降低、皮肤干燥、色素沉积及红斑都与真皮胶原纤维分解和萎缩及其体现在空间结构上的真皮厚度、Ⅰ、Ⅲ型胶原比例导致及息息相关[8,9]。真皮内注射DMAE复合制剂可增加衰老治疗组大鼠皮肤真皮厚度、HYP含量，但是尚不能恢复到年轻大鼠水平，此外皮肤共聚焦显微镜观察显示衰老治疗组皮肤胶原纤维密度出现逐渐增加的趋势。DMAE复合制剂亦可使衰老大鼠胶原纤维密度、colⅠmRNA表达量显著增加并达到年轻大鼠水平，colⅢmRNA表达量在三组大鼠皮肤没有明显变化，但是衰老大鼠皮肤colⅠ、Ⅲ比例明显降低。由此我们推测：DMAE复合制剂可以促进衰老大鼠成纤维细胞合成胶原蛋白而发挥其抗衰老效果。

本研究发现，成纤维细胞PCNA的表达在衰老治疗组与衰老生理盐水组之间无明显差别，提示真皮内注射DMAE复合制剂不能诱导衰老大鼠皮肤成纤维细胞增殖，无细胞过度增殖产生变异和癌变的隐患。

皮肤胶原蛋白主要由皮肤成纤维细胞分泌合成，所以调节成纤维细胞分泌胶原蛋白的与抗皮肤衰老密切相关。研究表明胶原蛋白的降解与合成与皮肤皮肤多种细胞因子有关。TGFβ1作为组织纤维化的调控者，通过活化下游smads信号通路，参与组织细胞的增殖、生长、分化、重塑、伤口愈合等过程，在器官的纤维化和细胞外基质的分泌和调节胶原酶活性过程中有着至关重要的作用[12,13]。研究发现，中和TGFβ1抗体和敲除smad3的大鼠都可通过抑制胶原合成和纤维化相关基因的表达来一直纤维化效应，而增加TGFβ1和smad3的表达可促进胶原合成[15-17]。由此推断smad3是TGF-β/Smads致纤维化信号传导通路中至关重要的环节。TGFβ1通过磷酸化smad3，使之作为重要的调控因子直接调节成纤维细胞中的纤维化基因（ColIa1,ColIa2,ColVa2,ColVIa1,and ColVIa3、TIMP-1)发挥其生物学作用[18]。本研究发现真皮注射DMAE复合制剂可致衰老治疗组大鼠真皮成纤维细胞中TGFβ1、smad3mRNA的表达量较衰老族显著增加，且smad3基因表达量在B、C两组间没有差异，但是TGFβ1基因及蛋白表达量尚不能达到正常年轻大鼠皮肤的水平。以上研究表明DMAE复合制剂在基因水平上增加TGFβ1/smad3的表达量，从而进一步促进Ⅰ型胶原蛋白合成产生抗衰老效果。

4.小结

总之，本实验真皮内定位定量注射DMAE复合制剂可有效减缓皮肤衰老，且不会导致皮肤成纤维细胞过度增殖变异，具有一定的安全性。其抗衰老机制主要与增加Ⅰ型胶原蛋白合成及改善真皮结构有关，而Ⅰ型胶原蛋白合成与正调节TGFβ1/smads通路分子表达量密切相关。

参考文献

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图1 皮肤共聚焦显微镜下3组大鼠胶原纤维的变化

图2HE染色下3组大鼠皮肤真皮厚度的差异

图3 masson染色观察3组大鼠皮肤真皮胶原纤维密度的差异

图4 免疫组化检测3组大鼠皮肤PCNA表达量的差异

图5免疫组化检测3组大鼠皮肤TGFβ1表达量差异

表1

表2

△代表方差齐，*表示于衰老组相比P<0.05差异有统计学意义，#表示衰老治疗组与正常组相比差异有统计学意义。